2020年6月，beat365官方网站果树生理与栽培课题组在园艺领域顶级期刊Horticulture Research（一区）在线发表了题为“Loading calcium fluorescent probes into protoplasts to detect calcium in the flesh tissue cells of Malus domestica”的研究论文。该论文首次发现Fluo-8/AM等小分子荧光探针可以染色苹果果肉胞质中的Ca2+，可用于检测细胞质中Ca2+的时空变化。beat365官方网站硕士研究生仇丽娜为本论文第一作者，beat365官方网站王永章教授和屈海泳副教授为论文的共同通讯作者。该论文得到了国家重点研发计划项目（2016YFD0201120）的资助。

　　钙既是植物所必需的矿质元素，又是细胞信号物质，在细胞内的分布呈现出复杂的时空动态变化。园艺植物的许多生理病害由Ca2+分布不平衡和代谢失调引起的，如苹果苦痘病、梨褐斑病、番茄脐腐病等，果实品质受损，经济效益下降。在苹果生产过程中，对幼果喷钙、采后浸钙等处理能增强苹果果实硬度，延缓果实衰老软化，延长存储时间，提高果实外观品质，然而也有研究结果表明钙处理对果实品质没有影响，也不能降低苹果苦痘病的发病率。这些研究结果之所以相互矛盾，主要原因是钙能否被果肉细胞吸收及其在细胞中的作用尚不清楚。Ca2+荧光呈像是最直观有效的研究细胞Ca2+的方法。对于不易建立稳定转基因植物，如苹果、梨等果树，采用小分子Ca2+荧光探针装载进入细胞，非常有利于研究细胞中Ca2+的分布和变化，但是小分子荧光探针容易发生‘区室化’现象，降低了他的可靠性。

　　Fig.1 Protoplasts were obtained by enzymatic hydrolysis.

　　本研究首次从成熟‘富士’(Malus domestica Borkh. cv. Fuji)苹果果肉组织细胞中通过酶解获取原生质体，在37°C（30 min）下将小分子荧光试剂装载到原生质体中，通过观察荧光显微镜检测果肉组织细胞质中的Ca2+。以目前最常用的Fluo-8/AM、Fluo-4/AM和Rhod-2/AM这3种荧光试剂进行果肉原生质体染色，采用Ca2+通道阻断剂La3+、Ca2+螯合剂EGTA、Ca2+载体A23187和Ionomycin，调节细胞内的Ca2+浓度，检测荧光值的变化。主要结果：（1）经FDA检测，酶解分离出的苹果果肉原生质体具有活性；（2）Fluo-8/AM等化学荧光试剂可以成功染色苹果果肉胞质中的Ca2+，当终浓度为5 μmol/L时荧光强度最强，且无‘区室化’现象。（3）La3+和EGTA处理，在25 min内荧光完全猝灭；A23187和Ionomycin处理原生质体在10 min时荧光强度达到峰值。此外，当La3+降低原生质体的荧光后，A23187可以恢复Ca2+荧光值。总之，Fluo-8/AM等小分子荧光探针可以染色苹果果肉胞质中的Ca2+，可用于检测细胞质中Ca2+的时空变化。该方法可促进果实硬度形成机理的解析，有利于研发新技术提高苹果果实的质地，提高果品品质。

　　Fig. 2 Loading of three kinds of Ca2+ fluorescent dyes into the protoplasts from flesh cells

　　Fig. 3 Fluorescence changes in Ca2+ in the same protoplast within 25 min. Pictures were taken every 5 min.

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41438-020-0315-3